Introducción

La ingeniería genética se inició hace un poco más de diez años con una serie de descubrimientos que permitieron manipular genes e introducirlos en células vivas, abriendo un campo enorme de aplicación en la industria, medicina y agricultura. La ingeniería genética se basa en el hecho que todas las especies que conocemos usan el mismo idioma de cuatro bases nucleotídicas que contiene la información genética y la misma maquinaria biológica para expresar la información contenida en dicho idioma. Es evidente que los logros de estas nuevas tecnologías han conferido al hombre la capacidad de cambiar artificialmente el material genético de los organismos vivos al introducir características nuevas en células vivas, alterando la evolución de las especies que se rige por las leyes de la selección natural.

Las consecuencias de la aplicación de la ingeniería genética en ganadería son incalculables al reducir las pérdidas económicas previniendo algunas enfermedades infecciosas mediante vacunas manufacturadas con estas nuevas técnicas o aumentar la producción de carne y leche a través de promotores del crecimiento. Ciertos productos, tales como anticuerpos monoclonales y vacunas en base a ingeniería genética ya se están introduciendo en el mercado, otros como las hormonas del crecimiento para pollos y bovinos emergen como posibles productos de esta revolucionaria tecnología.

Con respecto a la importancia de desarrollar nuevas vacunas para prevenir enfermedades virales de los animales domésticos, es necesario destacar que muchas enfermedades infecciosas no han sido controladas por la carencia de antibióticos adecuados o porque las vacunas en uso son inefectivas (Muscoplat, 1984). De acuerdo con la 'American Veterinary Medical Association', aproximadamente el 7% de 45 millones de terneros que nacen anualmente en los Estados Unidos de Norteamérica, mueren en los primeros seis meses de vida por causas infecciosas, lo que representaría unos cuantos billones de dólares en pérdidas económicas, causadas principalmente por enfermedades respiratorias, digestivas o reproductivas.

Las vacunas tradicionales, preparadas generalmente con el agente etiológico, han demostrado ser eficaces en la lucha contra un gran número de enfermedades infecciosas de mamíferos y aves; sin embargo no están exentas de reacciones indeseables de tipo alérgico o de causar algunas manifestaciones de la enfermedad como es el aborto en bovinos y equinos. Si bien es cierto muchos de los inconvenientes señalados para estas vacunas han sido superados mediante el perfeccionamiento de los métodos de preparación y control, aún subsisten problemas de potencia, inocuidad y conservación. Según Bachrach et al. (1983), existiría una real necesidad de contar con vacunas inocuas, estables y eficaces, de bajo costo de producción al producirse en grandes volúmenes, y que abarquen un mayor número de enfermedades.

Durante los últimos años se ha demostrado claramente que proteínas obtenidas de la superficie de algunos virus o bacterias, son capaces de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes que protegerían a los animales susceptibles contra la acción patógena de virus o bacterias homólogas; tal es el caso de la fiebre aftosa, en que pequeños fragmentos antigénicos constituidos por proteínas del virus aftoso han demostrado una gran capacidad inmunogénica, lo que ha permitido preparar vacunas con subunidades clonadas de este virus que al ser administradas en dos dosis protegen a bovinos y porcinos del virus patógeno (Kleid et al. (1981).

Los alentadores resultados obtenidos con vacunas preparadas con subunidades virales, han orientado el trabajo de diferentes laboratorios hacia la producción artificial de proteínas de superficie y sus fracciones activas, mediante clonaje molecular y síntesis orgánica. Estas 'proteínas vacunantes', clonadas o sintéticas, presentan algunas ventajas sobre las vacunas tradicionales, debido principalmente a que no son infecciosas; además no producen fenómenos secundarios indeseables y son más estables frente a variaciones de temperatura. Sin embargo es necesario advertir que el mayor inconveniente que presentan las vacunas subunitarias es su condición de experimentales.

Nuevas metodologías

La investigación biológica se encuentra en las fronteras de una nueva era, en que técnicas de gran resolución harán posible el paulatino esclarecimiento de los secretos de la vida. Estos avances han permitido profundizar en el funcionamiento celular, desentrañando progresivamente los mecanismos intrínsecos de las interacciones entre genes y enzimas, y los mecanismos básicos de la replicación viral. Coincidentemente, la investigación en ingeniería genética ha avanzado extraordinariamente en la última década, incluso más allá de lo que la misma ciencia ficción podía anticipar, es así como la recombinación del ADN o recomposición de genes (gene splicing), que consiste en la inserción de material genético de un organismo en otro, se ha convertido en un hecho común de la biología molecular como una nueva forma de intervención humana en la evolución de los organismos a través de la manipulación directa de genes.

El accionar de la ingeniería genética implica una serie de manipulaciones efectuadas a nivel de genomas celulares o virales realizadas con el fin de obtener productos genéticamente codificados como pueden ser por ejemplo, proteínas inmunogénicas. Estas manipulaciones comprenden recombinaciones genéticas, clonaje y transferencia de ADN, fusión celular y la inducción o represión de la expresión del genoma.

El clonaje molecular consiste en introducir un fragmento de ADN, un gen por ejemplo, en un ADN viral o en un plasmidio bacteriano, y el ADN resultante se transfiere a una célula huésped para su multiplicación y expresión. Es posible unir el material genético de una célula con el de otra, perteneciente a otra especie, debido a que ambos ADN tendrán terminales cohesivos cuando son tratados con las mismas enzimas de restricción. Generalmente la célula huésped es la bacteria E. coli. También se ha logrado introducir genes en células eucarióticas utilizando el virus oncogénico (SV–40) como vector. El tratamiento con fosfato de calcio, permite la entrada de ADN en las células animales.

La técnica de los anticuerpos monoclonales se refiere a la producción de anticuerpos que constituyen una población homogénea de moléculas idénticas, elaborados por un hibridoma que resulta de la fusión de células productoras de anticuerpos o linfocitos y de células neoplásicas de mieloma. Los híbridos tienen una capacidad ilimitada de multiplicarse, similar a las células de mieloma, y tienen la propiedad de producir un solo tipo de anticuerpos, característica heredada del linfocito que ha sido obtenido de un ratón inmunizado. El proceso de producción de anticuerpos monoclonales dura tres a cuatro meses para cada experimento de fusión.

En virología, los anticuerpos monoclonales han sido usados para construir mapas antigénicos de la hemoaglutinina del virus influenza, y para realizar trabajos que permitan entender el comportamiento de los cambios genéticos en poblaciones naturales, a través de la estimación de la frecuencia de mutación del virus influenza al ser cultivado en presencia de anticuerpos monoclonales neutralizantes; en estas condiciones, solamente los viriones que han mutado y cambiado sus antígenos reconocidos por el anticuerpo monoclonal podrán multiplicarse. Se ha encontrado que la frecuencia de mutación 'in vitro' del virus rábico es muy semejante al virus influenza, lo que es sorprendente ya que las variantes naturales del virus rabia son más bien raras.

La clonación del gen de la proteína viral 1(PV1) del virus aftoso involucra inicialmente la producción de copias de cADN con la enzima transcriptasa inversa y la digestión del ARN templado que deje solamente al cADN. Mediante una ADN polimerasa el cADN se transcribe a ADN doblehebra; se digiere el ADN monohebra, eliminándose copias pequeñas. Ahora se le pega 'colitas' (dC) con deoxycytidina y transferasa terminal, insertándose el ADN y su 'colita' en un plasmidio modificado en E. coli. Luego de la multiplicación de la bacteria, los nuevos plasmidios producidos son extraídos mediante enzimas de restricción, obteniéndose 1 x 106 genes clonados, que deben ser caracterizados para identificar el área del ARN para lo cual ellos codifican, y determinan la secuencia requerida de la PV1, eliminando las otras bases. El gen es insertado, en la correcta orientación, en un vector adecuado de expresión, un plasmidio que se inserta en la bacteria E. coli, la que al multiplicarse va a producir la proteína en cuestión que al ser extraída adecuadamente podrá ser usada en la preparación de vacunas.

También se han producido péptidos sintéticos correspondientes a las regiones de aminoácidos 141 a 160 de la PV1 del virus aftoso, las que al ser inoculadas en bovinos y porcinos producen anticuerpos neutralizantes. Estos resultados indican que antígenos sintéticos serían mejores inmunógenos que las PV1 extractada del virus o preparada mediante ingeniería genética. Es interesante agregar que las técnicas de ingeniería genética permitirán en el futuro la producción de nuevos tipos de virus aftoso atenuados o modificados, al afectar las secuencias específicas del ARN que codifica la proteína que permite la entrada del virus a la célula y expresar su infecciosidad.

Vacunas de subunidades

Los promisorios resultados obtenidos con vacunas preparadas con subunidades naturales, han dirigido la investigación hacia la producción artificial de proteínas de superficie, de virus o bacterias, mediante síntesis orgánica o clonaje molecular; la síntesis orgánica de polipéptidos y proteínas mediante procedimientos manuales o automáticos, es una técnica de química orgánica desarrollada bastante tiempo atrás; mientras que el clonaje molecular es una técnica relativamente nueva, que consiste en introducir un fragmento de ADN, un gene que codifica la proteína que se desea producir, en un ADN vector de doble cadena que puede ser un plasmidio bacteriano o un ADN viral, y este ADN se transfiere a una célula huésped (pro o eucariótica) para su multiplicación y consiguiente expresión en la producción de la proteína deseada.

La preparación del ADN codificado ofrece algunas dificultades, en el caso de los virus ARN es necesario preparar un ADN complementario de doble cadena, tratando el ARN viral con la enzima transcriptasa reversa. Si el ARN es policistrónico es necesario determinar la secuencia de aminoácidos de la proteína que se va a producir para identificar la fracción correspondiente en el ADN complementario; en el caso de proteínas codificadas por un ARN monocistrónico, es posible preparar el ADN necesario sin establecer previamente la secuencia de la proteína o de los ácidos nucleicos.

Las proteínas clonadas o sintéticas, usadas como vacunas, presentan ciertas ventajas sobre las vacunas clásicas, debido principalmente a que no derivan directamente de partículas virales y por lo tanto no son infecciosas; además son estables a 'variaciones de temperatura y no provocan fenómenos secundarios. Estas vacunas de subunidades tienen un potencial de aplicación en enfermedades virales, bacterianas, parasitarias y oncogénicas.

VACUNAS DE SUBUNIDADES ANTIVIRALES

Los virus se clasifican en familias llamadas 'Viridae', que comprenden o agrupan virus con un genoma similar que implica que presenten tipos y cantidades de proteínas muy semejantes entre sí, además de replicarse con una estrategia parecida.

En el cuadro siguiente, tomado de Bachrach (1983) se agrupan los virus según sus familias, indicándose los elementos estructurales con posibilidad de usarse en la preparación de vacunas a subunidades contra enfermedades virales de los animales domésticos. Estas estructuras son proteínas de superficie, que pueden actuar como inmunógenos reaccionando con anticuerpos neutralizantes o induciendo la producción de anticuerpos antivirales neutralizantes o precipitantes, en algunos casos protegiendo a los animales de un desafío con virus virulento.

A continuación se describen las principales familias virales y sus constituyentes proteicos posibles de ser usados como vacunas subunitarias.

CUADRO I Estructuras virales posibles de ser usadas en la preparación de vacunas sub–unitarias antivirales en los animales.

Familia

Virus

Inmunógeno aislado

Papovaviridae

Papiloma (Humano)

Ag T

Adenoviridae

Adenovirus

Hexones, pentones

Herpesviridae

Rinotraqueítis infecciosa bovina

Glicoproteína

Seudorrabia

Glicoproteína

Marek

Proteínas de membrana celular

Orthopoxviridae

Virus pox conejo

Ag soluble y HA

Parvoviridae

Parvovirus canino 2

Proteínas cápside

Reoviridae

Reovirus

Proteínas 1, 2 y 3

Orbiviridae

Lengua azul

Proteína p2

Rotaviridae

Simian virus II

Proteína p26; glicoproteína gp34

Picornaviridae

Fiebre aftosa

Proteína viral PV3

Caliciviridae

Exantema vesicular

Proteína p61

Togaviridae

--
-------Alphavirus

Semliki forest virus

Virus fragmentado, E1,3

-------Flavivirus

Encefalitis tick-borne

Glicoproteína V3

-------Pestivirus

Peste porcina clásica

Virus fragmentado, E1,2

-

Diarrea viral bovina

Virus fragmentado, E1,2

Coronaviridae

Gastroenteritis transmisible del cerdo

Glicoproteína

Orthomyxiviridae

Peste aviar

HA

Bunyaviridae

Fiebre Rift Valley

Glicoproteína G1-2

Arenaviridae

Coriomeningitis linfocitaria

GIicoproteína

Paramyxoviridae

Virus Enf. Newcastle

HA y NA

Parainfluenza - 3

Proteína F

Rhabdoviridae

Estomatitis vesicular

Glicoproteína G

Rabia

Glicoproteína G

Retroviridae

Virus Friend

Glicoproteína gp 71

Leucemia felina

Ag soluble célula tumoral

Leucemia Maloney

Fragmentos virales

(Bachrach, 1983)

Clase I (± ADN): En esta clase de virus se necesita un ADN doblehebra, para iniciar la infección. Corresponde a Papovaviridae, Adenoviridae y Herpesviridae. El clonaje del ADN del virus verruga humano (Papovavirus) ha sido ensayado para preparar una vacuna. En lo que se refiere a los adenovirus se ha informado que las fibras de hexonas y pentones son capaces de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes. En cuanto a los virus herpes, se ha descrito que el pollo queda protegido contra la enfermedad de Marek luego de dos inyecciones de una suspensión de dos proteínas obtenidas desde membrana plasmática de células infectadas con el virus herpes del pavo; una glicoproteína extraída del virus RIB (VHB–1) induce la producción de anticuerpos específicos en conejos y bovinos; similarmente, dos vacunaciones mediante una glicoproteína del virus de la enfermedad de Aujeszky produce anticuerpos neutralizantes y protege al cerdo contra el desafío vía intranasal.

Clase I (± DRNP): Se requiere desoxirribonucleoproteína doblehebra para iniciar la infección de los virus Pox. El virus de la vacuna puede ser útil en ingeniería genética como vector de clonaje y de expresión para genes extraños en los animales.

Clase ll: Poseen genoma ADN monohebra. Proteínas de la cápside del parvovirus canino han sido aisladas y clonadas, y al ser inoculadas en cobayos y ratones inducen la producción de anticuerpos neutralizantes.

Clase III: Ribonucleoproteínas de doblehebra y segmentadas inician la infección. En los Reovirus se describe que una proteína de la cápside externa induce la producción de anticuerpos neutralizantes; la proteína p2 de los Orbivirus tiene buenas posibilidades de ser usada como proteína vacunante debido a que existe una buena correlación entre los títulos de anticuerpos precipitantes que induce y los títulos de anticuerpos neutralizantes en sueros anti virus lengua azul, además que anticuerpos monoclonales p2 específicos son capaces de inmunizar pasivamente a ovejas contra el virus de la lengua azul.

Clase IV: En esta clase inicia la infección el genoma ARN monohebra. En el contexto de la ingeniería genética, uno de los virus más estudiados es el Picornavirus causante de la fiebre aftosa. Dos vacunaciones con la proteína PV3, aislada del virus o clonada en E. coli, producen suficientes cantidades de anticuerpos neutralizantes para proteger a bovinos y porcinos contra el desafío con virus virulento. Un fragmento de 13 kd, que contiene los aminoácidos 55 a 179 de la proteína de superficie del virus tipo A, protege a porcinos y bovinos contra una prueba virulenta con el virus homólogo; resultados semejantes se han obtenido mediante la doble vacunación con una proteína recombinante del tipo A producida por E. coli. La aplicación de una dosis de un péptido sintético con 20 aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 141 a 160 de la misma proteína de superficie pero conjugada con una proteína portadora, ha inducido la producción de tasas elevadas de anticuerpos neutralizantes en conejos y ha protegido frente a la infección con virus aftoso homólogo. Un péptido sintético de 20 aminoácidos de las proteínas de superficie de dos sub–tipos A también ha inducido anticuerpos neutralizantes. Estos resultados obtenidos en conejos demuestran que los péptidos de síntesis pueden proteger a las especies susceptibles a la fiebre aftosa, especialmente en el caso de bovinos y porcinos.

Con respecto a los Calicivirus, solamente podría usarse la proteína mayor del virus del exantema vesiculosos del cerdo en la preparación de vacunas subunitarias. Los Togavirus presentan las siguientes posibilidades: género Alfa, con una glicoproteína miceliada se obtiene una buena protección contra el virus Semliki Forest; género Flavi, usando complejos de polímeros de la glicoproteína V3 proveniente del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, se inducen títulos de anticuerpos seroneutralizantes e inhibidores de la hemoaglutinación, que al ser comparados con la vacuna preparada con el virus completo, fueron diez veces más activos, presentando además una protección similar en ratones frente a una prueba de desafío. En el género Pesti, con glicoproteínas del virus peste porcina clásica se ha obtenido la formación de anticuerpos neutralizantes que han protegido a cerdos contra el virus peste porcina. Experiencias semejantes realizadas con el virus de la diarrea viral bovina, han sido menos efectivos. La aplicación de dos dosis de glicoproteínas del virus de la gastroenteritis transmisible del cerdo han sido suficientes para producir anticuerpos neutralizantes y proteger a cerditos recién nacidos contra la exposición directa o por contacto del virus virulento.

Clase V (Seg.): En este grupo se requiere ribonucleoproteína segmentada con polaridad negativa para iniciar la infección. Como ejemplos tenemos: virus de las Familias Orthomyxoviridae (8 segmentos); Bunyaviridae (3 segmentos); y Arenaviridae (2 segmentos). Una vacuna comercial contra la influenza o gripe, preparada con virus degradado, produce seroconversión y menores problemas secundarios que las vacunas preparados con virus entero. El gen del principal inmunógeno viral es decir la hemoaglutinina (HA), ha sido clonado y expresado en E. coli, constatándose que cada célula produce 108 moléculas de HA las que absorben específicamente eritrocitos y anticuerpos anti virus. Las moléculas de HA podrían ser usadas en la preparación de vacunas subunitarias. Una vacuna de subunidades que contiene los dos elementos del virus de la influenza, hemoaglutinina y neuraminidasa (NA), ha demostrado grandes posibilidades inmunoprofilácticas, al menos en experimentos realizados en ratones.

El clonaje y expresión de los genes de las glicoproteínas G1 y G2, están en desarrollo, pudiendo eventualmente ser usadas en la preparación de vacunas contra la fiebre del Valle de Rift que es una zoonosis.

Clase V (No segmentada): Las familias Paramyxoviridae y Rhabdoviridae pertenecen a esta clase que contiene ribonucleoproteína no segmentada de polaridad negativa. Los paramyxovirus poseen dos glicoproteínas de superficie, HA y NA, y una proteína F con actividad de fusión celular; estas proteínas inducen la producción de anticuerpos neutralizantes contra los virus Newcastle y Parainfluenza–3, mientras que la proteína F induce anticuerpos que impiden la difusión de los virus entre las células por fusión de membranas.

Los rhabdovirus poseen una glicoproteína G, que es una hemoaglutinina inmunógena; las subunidades del virus rábico o la glicoproteína G inducen la producción de anticuerpos neutralizantes, confiriendo inmunidad a los animales vacunados. Tanto la glicoproteína G del virus rabia como la del virus estomatitis vesicular han sido clonadas en E. coli. Se espera que estas proteínas clonadas sean inmunógenos útiles contra la rabia, ya que algunas vacunas antirrábicas preparadas con el virus entero pueden provocar ocasionalmente reacciones neurológicas graves.

Clase VI: La ribonucleoproteína viral es replicada mediante una enzima transcriptasa inversa. Estos virus tienen glicoproteínas en su envoltura que tienen actividad inmunogénica; la glicoproteína gp7 1 aislada del virus Friend leucemia murina, inmuniza a ratones en una prueba de desafío. Por otra parte, vacunas preparadas con subunidades del virus de la leucemia felina y antígenos solubles de células tumorales protegen aproximadamente al 80% de los ratones en una prueba de desafío. Resultados semejantes obtenidos en enfermedades causadas por retrovirus, tales como leucemia bovina, anemia infecciosa equina y la leucemia linfoma de células T del hombre, constituirían una etapa decisiva en la lucha contra el cáncer.

VACUNAS DE SUBUNIDADES ANTIBACTERIANAS

Las técnicas de ingeniería genética también se han aplicado con éxito en la preparación de vacunas de base proteica contra las enfermedades bacterianas, especialmente con pilis somáticos de E. coli enterotóxicos que provocan diarreas en los recién nacidos. Estos pilis somáticos son apéndices no flagelares constituidos por proteínas de 14 a 22 kd llamadas pilinas, que facilitan la adhesión de la bacteria a la mucosa intestinal. Se han aislado cepas inmunológicamente distintas de E. coli enterotóxicas: K88 y 897P en el cerdo, K99 en el bovino, ovino y porcinos. Pilis aislados han sido utilizados como vacunas contra las diarreas causadas por estas bacterias en el hombre y en los animales.

En varios países europeos se ha realizado la producción por clonaje de ciertos pilis codificados por plasmidios; algunos genes de las pilinas son codificados sobre cromosomas: 897P. La transferencia de los plasmidios a huéspedes menos patógenos tales como E. coli K–1 2 se está desarrollando en varios laboratorios; estas vacunas experimentales se están probando en cerdos.

Conclusión

No es improbable que las vacunas sintéticas preparadas con proteínas inmunogénicas específicas, desarrolladas con nuevas técnicas de ingeniería genética, reemplacen a las vacunas tradicionales, al menos en aquellos casos en que no se dispone de vacunas eficientes y de bajo costo de producción. La elaboración de vacunas antivirales en base a esta nuevas metodologías permitiría augurar, probablemente a corto plazo, interesantes perspectivas en la inmunoprofilaxis de las principales enfermedades infecciosas que afectan a los animales domésticos. Conjuntamente con el desarrollo de mejores técnicas de diagnóstico serológico basados en la especificidad, uniformidad y disponibilidad de anticuerpos monoclonales, que permitirán además, identificar antígenos capaces de generar una respuesta inmune protectiva.

Finalmente es posible deducir por lo expuesto previamente, que la aplicación de la ingeniería genética en la preparación de nuevas vacunas preparadas con subunidades virales, dependerá, paradojalmente no tanto de la complejidad de la tecnología, sino de aspectos económicos y comerciales que encarecen en forma desmedida los productos vacunales, haciendo que sean inalcanzables para poderes compradores potenciales de bajo nivel adquisitivo.

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