Introducción

La cáscara del huevo de aves es un notable ejemplo de mineralización biológica. Tanto las cáscaras de huevos de aves y algunos reptiles, como las conchas de moluscos, los huesos y los dientes son fabricados combinando fibras orgánicas con cristales inorgánicos. Estas cerámicas naturales son producidas a relativamente bajas temperaturas y mediante mecanismos biológicos que el hombre no ha podido reproducir aún. Desgraciadamente no es mucho lo que se conoce acerca de los procesos que operan en la mineralización biológica. Es así entonces que la cáscara de huevo se ofrece como un inapreciable modelo para estudiar procesos de calcificación y mineralización biológica, debido a su fácil disponibilidad bajo costo y relativa simpleza.

Las primeras caracterizaciones de la estructura de la cáscara del huevo datan del siglo pasado. Los estudios pioneros de Wilhelm von Nathusius en la mitad del siglo 19 ya mostraron que la cáscara del huevo de gallina corresponde a una intrincada y altamente ordenada estructura compuesta de múltiples capas y matrices calcificadas (ver Tyler, 1964). Por otra parte Dickie (1848) sugirió erroneamente que la cutícula que recubre el huevo externamente era un epitelio dispuesto sobre una membrana.

No obstante, si se considera la época en que fueron realizados, resulta necesario destacar los estudios visionarios de Purkyne (1855).

Este genial investigador checo fue capaz de observar detalladamente y dibujar con extraordinaria aproximación muchas de las imágenes de la cáscara de huevo que hoy sólo se obtienen mediante microscopía de barrido.

Estudios posteriores han contribuído a precisar aún mas la estructura de la cáscara del huevo. Sin embargo, no se dispone de una recapitulación actualizada, bajo la óptica de la biología celular que relacione en un todo coherente la estructura morfológica, la composición química y la función biológica de la cáscara del huevo.

La presente revisión, que forma parte de un proyecto de síntesis de compuestos cerámicos utilizando principios de biomineralización y que se encuentra en desarrollo con la participación del Laboratorio de Biología Celular del Departamento de Ciencias Biológicas Animales de la Universidad de Chile y del Skeletal Research Center del Departament of Biology de Case Western Reserve University, pretende ser una recapitulación comprensiva e integrativa de este importante compartimento acelular formado por componentes de matriz extracelular mineralizados.

Estructura de la cáscara del huevo

La cáscara del huevo puede ser descrita como conformada por diversas capas dependiendo del metodo de extracción, de la composición o del método de análisis (Fig.1). Una rápida observación y extracción manual permite reconocer dos capas, una exterior calcificada y una interior membranosa. Sin embargo, una observación algo mas detallada ha permitido llegar a acuerdo en reconocer cuatro capas principales que se hacen mas o menos evidentes mediante las diversas metodologías empleadas en el estudio de la estructura, composición química o función de porciones discretas de la cáscara. No obstante, muchos autores también coinciden en la dificultad de definir plenamente la tercera capa (mamilar) ya que corresponde a una zona de notable imbricación de las porciones mas interiores de la segunda capa con las porciones mas exteriores de la última capa.

Desde el punto de vista de los procesos de desarrollo y mineralización de la cáscara bien deberían considerarse sólo tres capas de las cuatro que se mencionarán aqui, mientras que desde un punto de vista molecular, ultraestructural y de su disposición dentro del huevo se podrían considerar también cuatro, aunque distintas a las que se trataran en esta revisión. como resultado de separar la capa mas interior (membranas de la cáscara) en dos capas (vide infra).

Considerando estas salvedades, en este trabajo se analizarán sólo las cuatro capas principales sobre las cuales parece haber un tácito acuerdo entre diversos autores. No obstante, cada vez que sea necesario se hará referencia a su subdivisión, sinonímia o exclusión. De acuerdo con todo lo anterior, se considerarán como capas las siguientes, a saber: a) cutícula, b) empalizada, c) mamilar, y d) de las membranas de la cáscara.

Capa cuticular o cutícula

Corresponde a la capa mas exterior del huevo que recubre por completo la porción calcificada de la cáscara y tiene un espesor promedio de 10 um. Su superficie es irregular dado que su espesor varía en diversas regiones del huevo entre 0,5 a 12,8 µm (Parsons, 1982). Estas diferencias de espesor son el reflejo de la presencia de hendiduras estrelladas o escamosas algunas de las cuales marcan la apertura de los poros de la cáscara (vide infra) y los cubren en forma de tapones.

En estas regiones la cutícula se presenta más gruesa. La cutícula resulta fácilmente extraible sumergiendo los huevos enteros en 5% EDTA por 90 min (Baker y Balch, 1962) o   en 0,25% hipoclorito de sodio a   40° C por 5 min (Peebles y Brake, 1986). Aunque en algún momento se consideró que la cutícula tenía una composición similar a las membranas de la cáscara (Romanoff y Romanoff, 1949), su principal composición es mucina (Moran y Hale, 1936; Cook y Balch, 1970), es decir, glicoproteínas de alto pesos molecular asociadas a moléculas de carbohidratos, (Roussel et al., 1988).

Contiene también algo de lípidos. Sin embargo sus componentes no han sido bien caracterizados mas allá de saber que sus proteínas contienen numerosos enlaces disulfuro y grupos sulfhidrilos libres (Simkiss, 1958), y que poseen mayor contenido en lisina, glicina y tirosina que las proteínas de las otras capas de la cáscara, y que contienen galactosa, manosa, fucosa y hexosamina, aunque no presentan ácido glucurónico (Baker y Balch, 1962).

Aunque su presencia parece proteger al huevo de invasiones bacterianas, posiblemente debido a mecanismos de reconocimiento y ligamiento de bacterias a través de los residuos de carbohidratos como los que han sido descritos para diferentes glicoproteínas (Roussel et al., 1988), su principal función es contribuir a la prevención de la excesiva pérdida de agua desde el huevo y favorecer el intercambio de gases. Sin embargo la pérdida de agua es principalmente dependiente de la humedad ambiente y secundariamente de la cutícula por si misma (Peebles y Brake, 1986; Peebles et al., 1987). La cutícula posee una alta conductancia para los gases comparada con la de la capa que le sigue (Pagnelli, 1980). Dicho de otra manera, la humedad ambiente está mas estrechamente relacionada con la pérdida de agua del huevo, en tanto que la remoción de la cutícula influye estrechamente el intercambio gaseoso.

Aunque no resulta fácil estudiar por separado los procesos de intercambio gaseoso y la pérdida de agua, se ha sugerido que la remoción de la cutícula podría mejorar el intercambio gaseoso si se ajusta apropiadamente la humedad en orden a impedir la excesiva pérdida de agua (Peebles et al., 1987). En algunas especies de aves, como la codorniz, la cutícula se presenta mineralizada aunque no cristalizada (Quintana y Sandoz, 1978).

Capa en empalizada o esponjosa

Esta capa, calcificada, no resulta fácil de definir por cuanto es arbitraria la exacta línea de demarcación entre la región mas interna de esta capa y la capa mamilar que se reconoce inmediatamente por debajo.

Sin embargo, operacionalmente se ha definido esta capa como aquella que empieza por sobre los botones mamilares donde los cristales se hacen confluentes y que termina en la cutícula (Parsons, 1982). Corresponde a la capa de mayor espesor (200 pm) y está compuesta de una parte inorgánica (carbonato de calcio) y una parte orgánica que se obtiene luego de descalcificar con 20% EDTA. llamada matriz de la cáscara.

Los estudios cristalográficos reconocen en esta capa tres subzonas o láminas (Terepka, 1968; Perrott et al., 1981; Silyn-Roberts, 1984): a) Zona de cristales verticales o lámina exterior. Es la más externa (3-8 µm de espesor) y se encuentra por debajo de la cutícula y corresponde a una región en la que los cristales se orientan preferentemente de manera perpendicular a la superficie del huevo y contiene menor número de vesículas llenas de gas entre los cristales que las zonas mas profundas (Parsons, 1982).

Se ha sugerido que en esta zona se genera por agregación de cristales de carbonato de calcio (calcita) una vez que ha cesado la deposición de matriz orgánica (Fujii, 1974). b) Zona o lámina central. En esta Zona los cristales van perdiendo gradualmente su orientación hasta no mostrar ninguna orientación proferencial, y entre ellos se encuentran abundantes vesículas llenas de gas. Aunque esta ha sido llamada orientación al azar, bien podría corresponder a una orientación determinada por la disposición irregular de la matriz orgánica presente en esta zona y no producto del azar. Convendría recordar aquí los pensamientos del matemático Laplace acerca del azar cuando postulaba que el azar es el recurso ignorante de quién no es capaz de conocer o averiguar las causas eficientes de un fenómeno. c) Zona de conos. Esta Zona, la más interna de esta capa, se encuentra formada por cristales que no muestran orientación cristalográfica preferencia) pero que confluyen a los botones mamilares. Corresponde en su parte mas interna a los sitios iniciales de calcificación.

Tanto la parte mineral como la orgánica de la capa en empalizada está estructurada en columnas entre las cuales se delimitan los poros de la cáscara. Estos poros consisten de una abertura en forma de embudo por debajo de la cutícula, y en la gallina , de un canal único no ramificado que termina entre los botones mamilares. En otras especies de aves los canales de los poros suelen tener variadas ramificaciones (Ver board,1982). Su superficie interna es irregular. Un huevo de gallina presenta entre 7.000 a 17.000 poros (Tyler, 1953) los que suelen estar más concentrados en el lado más obtuso del huevo (Romanoff y Romanoff, 1949) y su densidad en el huevo está inversamente relacionada con la mortalidad embrionaria (Peebles y Brake, 1985).Su función esta directamente relacionada con el intercambio gaseoso, siendo la capa en empalizada la capa más resistente al paso de los gases (Pahanelli, 1980). Esta permeabilidad a los gases va aumentando con el desarrollo del huevo (Kutchai y Steen. 1971).

La naturaleza altamente ordenada de esta capa se relaciona con la particular disposición de los cristales en la matriz orgánica. Los cristales de carbonato de calcio forman columnas y sus ejes-C cristalográficos, especialmente en la zona exterior de la capa, se orientan perpendiculares a la superficie de la cáscara. El análisis infrarrojo de material obtenido de la intersección de esta capa mamilar ha permitido detectar la presencia de pequeñas cantidades de fosfato (Lorenz et al., 1943), Sin embargo, no se conoce bien si tal fosfato es de origen orgánico o inorgánico. Tal cuestión podría ser de gran importancia para entender los mecanismos de calcificación que están operando en este interesante modelo de biomineralización. De todas formas la relación Ca/P es mayor en la cáscara que en los huesos.

Por otra parte la matriz de la cáscara, esto es, aquel material remanente a la descalcificación de la capa en empalizada, se encuentra íntimamente asociada a los cristales de carbonato de calcio, y forma una banda continua alrededor del huevo. Estudios clásicos han demostrado en la matriz la presencia de glicoproteínas y de 'proteínas-polisacáridos' (Simkiss y Tyler, 1957), término en desuso, que bien debería corresponder a lo que actualmente se conoce como proteoglicanos. Tal constitución ha sido inferida a partir de la determinación en esta matriz de glucosamina, galactosamina, galactosa, manosa, fucosa y ácido siálico (Baker y Balch, 1962; Frank et al .,; 965; Salevsky y Leach, 1980). Polisacáridos(11 %) y proteínas(70%)constituyen la mayor parte de los componentes de esta matriz.

La presencia de proteoglicanos ha sido inferida especialemente dado que la composición aminoacídica de la porción protéica es similar a la del núcleo protéico del proteoglicano de condroitín sulfato del cartílago, y directamente debido a que se han detectado glicosaminoglicanos del tipo condroitín 4- sulfato y dermatan sulfato como constituyendo el 35% del total de polisacáridos de la matriz de la cáscara (Baker y Balch,1962; Leach, 1982). Sin embargo, se desconoce la real naturaleza y composición de estos eventuales proteoglicanos. Si se conoce que los componentes de la matriz de la cáscara, especialemente carbohidratos, no estan uniformemente distribuidos en la capa (Cook y Balch, 1970 b). Su estudio resulta vital para tratar de conocer su rol en el proceso de calcificación.

Cuando la capa en empalizada se descalcifica con EDTA se obtiene una fracción soluble (40%) y otra insoluble (60%). De la fracción soluble se ha obtenido ácido hialurónico (Heaney y Robinson, 1976) y algunas proteínas que presentan alta afinidad por calcio (Krampitz y Engels, 1974; Abatangelo et al., 1978; Hamm et al., 1979; Krampitz et al ., 1980; Cortivo et al., 1982) (Figura 2).

Estas proteínas presentan abundantes resíduos de aminoácidos ácidos (aspártico y glutámico) e incluso en algunas de ellas se ha detectado ácido  γ-carboxiglutámico. Este ácido corresponde a una modificación postraduccional del ácido glutámico que es regulada por la vitamina K. Esta proteína que contiene ácido γ-carboxiglutámico ha sido denominada ovocalcina (Krampitz et al., 1980) Otros sistemas biológicos que se mineralizan como huesos, dientes y conchas de moluscos también poseen proteínas ricas en estos resíduos. Nosotros hemos encontrado (Arias et al. datos no publicados) que extracto crudo de matríz de la cáscara resulta clave para conseguir cristalización de fosfato de calcio sobre las membranas de la cáscara in vitro.

Tales evidencias sugieren fuertemente que estos grupos carboxílicos ionizados son los principales responsables del ligamiento a los iones de calcio. Adicionalmente ha sido destacada en la matriz la presencia de anhidrasa carbónica (Krampitz et al., 1974). Muchas de las proteínas de la cáscara son sintetizadas en el hígado y no en la glándula de la cáscara de oviducto (Eckert et al., 1986; Schade, 1987).

Aunque Baker y Balch (1962) no encuentran hidroxiprolina y sí bastantes aminoácidos dicarboxílicos y básicos, y pocos aromáticos y azufrados, lo que sugiere la ausencia de colágeno, algunos otros autores posteriores si han encontrado hidroxiprolina (Candlish y Scougall, 1969; Banmister et al., 1971; Abatangello et al., 1978) confirmando la naturaleza colagenosa de algunas de las proteínas de la matriz de la cáscara.

En resumen, la capa en empalizada consiste de columnas ordenadas de cristales de calcita los que han cristalizado mediante la participación, hasta hoy no muy bien comprendida, de los componentes de la matriz de la cáscara. La importancia de la matriz de la cáscara se evidencia en el hecho que los huevos que no presentan cáscara calcificada tampoco presentan componentes de su matriz (Mather et al., 1962).

Capa mamilar

Corresponde a una capa de 100 µm de espesor caracterizada por la presencia de acumulaciones discretas de materia orgánica que se entremezclan con el material fibrilar de la subcapa exterior de las membranas de la cáscara. Su botones o mamilas corresponden a los sitios donde se inicia la formación de cristales de la cáscara. Son difíciles de distinguir con microscopía electrónica de barrido y sólo se hacen evidentes en secciones descalcificadas. Los botones mamilares son ricos en mucolisacáridos neutros (Robinson y King, 1968; Robinson, 1970), ricos en hexosaminas, ácido siálico y hexosas (Cooke y Balch, 1970a). La falta de ácido urónico hace sugerir a estos autores que proteoglicanos del tipo condroitín sulfato no jugarían un rol en el inicio de la calcificación de la cáscara. Sin embargo, mediante inmunocitoquímica de anticuerpos monoclonales especifícos nosotros hemos detectado la presencia de condroitín-4-sulfato, dermatan sulfato en los botones mamilares (Arias et al datos no publicados). También se ha detectado en ellos la presencia de anhidrasa carbónica (Robinson y King, 1963).

Diversos estudios parecen coincidir en que existiría una estrecha y directa relación entre la densidad de botones mamilares, espesor de la cáscara y calidad de la misma (Robinson y King, 1970a, Simons, 1971; Fujii, 1974;Bunk y Balloun, 1978).

Capa de las membranas de la cáscara

Corresponde a la capa mas interior de la cáscara del huevo. Mide 70 µm de espesor y esta compuesta de dos láminas o subcapas fibrilares llamadas externa (48 µm) e interna (22 µm). Estas dos láminas o subcapas estan fuertemente adheridas entre si en la mayor parte de la superficie interior de la cáscara salvo en la porción obtusa del huevo en la cual se encuentran separadas por la cámara de aire. La lámina interna presenta fibras más finas que la capa externa y muestra una superficie lisa y homogénea debido a la presencia de un material no fibrilar conocido como manto (Bellairs y Boyde, 1969; Hoffer, 1971; Draper et al., 1972).

Los primeros estudios sugerían que las proteínas de las membranas de la cáscara eran similares a la queratina debido a su similar composición aminoacídica (Calvery, 1933; Baker y Balch, 1962). Así fue como erróneamente se llamó a esta capa, capa de ovoqueratina. Estudios posteriores han demostrado que tal descripción es incorrecta (Hoffer, 1971; Wedral et al 1974). De hecho el hallazgo de hidroxiprolina (Balch y Cooke, 1970) e hidroxilisina (Candlish y Scougall, 1969) constituyó la primera indicación de la naturaleza colagenosa de las proteínas de la membrana de la cáscara. Durante algún tiempo se pensó también en la elastina como constituyente de estas proteínas, debido especialmente a la presencia de desmosina e isodesmosina (Baumgarther et al., 1978   Harris et al., 1980; Starcher y King, 1980). Sin embargo, la proteína de las membranas de la cáscara es resistente a elastasa. Los entrelazos de desmosina e isodesmosina se forman extracelularmente por deaminación oxidativa de grupos

 -amino por acción de lisiloxidasa (enzima dependiente de Cu) y posterior condensación de tres residuos de alisina con un residuo de lisina (ver Davisdson y Giro, 1986; Kagan, 1986). Aunque estos entrelazos son característicos de la elastina también se encuentran en colágenos maduros (ver Kagan, 1986). El itsmo del oviducto posee una gran actividad de lisiloxidasa (harris et al., 1980) y las aves sometidas a restricción alimentaria de Cu o alimentadas con dietas latirógenas por adición de ß-amino-propionitrilo, un inhibidor de la lisiloxidasa, producen huevos con cáscaras deformes debido a un deficiente entrelazamiento del colágeno de las membranas de la cáscara (Baumgartner et al., 1978).Así mismo se conoce desde hace bastante tiempo que las dietas deficientes en ascorbato, vitamina esencial para la biosíntesis del colágeno por su participación en la hidroxilación de prolina y lisina (Minor, 1980), generan huevos con cáscaras de mala calidad (Thornton y Moreng, 1958; Thornton y Moreno, 1959). Aunque algunos autores (Leach et al., 1981) han sugerido que la proteína de las membranas de la cáscara sería una proteína rica en desmosina e isodesmosina pero distinta a la queratina, elastina y colágeno, estudios inmunohistoquímicos posteriores demuestran la presencia inequívoca de colágeno tipo I como principal componente de la subcapa externa, y de colágeno tipo V de la subcapa interna (Wong et al.,1984). Adicionalmente nosotros hemos encontrado una fuerte reacción a un anticuerpo monoclonal contra colágeno tipo X en ambas subcapas (Arias et al., datos no publicados).

El colágeno de las membranas de la cáscara se encuentra embebido en un material amorfo del tipo de los proteoglicanos, el que sería a su vez el principal componente del manto que recubre internamente las membranas (Wong et al.,1984). Nosotros hemos visto que tal material es digerible con papaína, e.inmucocito-químicamente es posible detectar queratan y dermatan sulfato, los que podrían confundirse con glicoproteínas sulfatadas descritas por Picard et al., (1973).

Aunque no se conoce muy bien la función precisa de las membranas de la cáscara, se sabe que su presencia y la normal conformación de su colágeno constituyente son fundamentales para asegurar una normal calcificación de la cáscara. Evidencias indirectas muestran que la estructura y organización de las membranas de la cáscara dirige el patrón topográfico de la deposición de carbonato de calcio. Así por ejemplo, cuando se coloca membrana de la cáscara en el lugar en que se ha desprendido un trozo de cáscara de caracol, la regeneración de la cáscara del molusco procede, pero el patrón de depósito de carbonato de calcio corresponde al de las cáscaras de huevo de ave y no al de la cáscara (concha) de caracol (Meenakshi et al., 1974).

Parte importante de las deformidades observables en huevos de gallinas viejas pueden ser relacionadas con deficiencias en la composición aminoacídica y espesor de las membranas de la cáscara (Britton, 1977, Britton y Hale, 1977; Blake et al., 1985). Así mismo se ha relacionado problemas de mortalidad embrionaria con el espesor de las membranas (Peebles y Brake, 1985)

Es justamente esta capa, en conjunto con la capa mamilar con la cual se confunde, la responsable de iniciar la calcificación de la cáscara (Creger et al., 1976; Stemberger et al., 1977). Sin embargo se desconocen los precisos mecanismos que operan en la mineralización de la porción más exterior de las membranas y en la matriz de la capa en empalizada.

Aunque la resistencia al paso de gases es mas importante en la capa en empalizada que en las otras capas (Paganelli, 1980), las membranas de la cáscara aumentan su permeabilidad al CO2 y al O2 durante la incubación (Kutchai y Steen, 1971). Este aumento de permeabilidad se debe, entre otras causas, a la solubilización de carbonato de calcio y movilización de calcio hacia el embrión, las que son producidas por la estrecha asociación que se establece entre la membrana corioalantoídea y las membranas de la cáscara a medida que progresa el desarrollo del embrión. Tal movilización de calcio se produce por transformación de carbonato de calcio en bicarbonato y no por solubilización por HCI como se ha sugerido (ver Narbaitz, 1974).

Reflexiones finales

Al igual que lo que ocurre en la formación de otros tejidos duros, el proceso de mineralización en la cáscara de huevos de ave se sucede esencialmente en las siguientes etapas: 1) elaboración de una matriz orgánica, 2) nucleación de la fase inorgánica sobre la superficie de la matriz orgánica, y 3) crecimiento de la fase inorgánica. Sin embargo se esta lejos de comprender la exacta naturaleza de los componentes químicos que configuran y participan en los procesos de mineralización de la cáscara del huevo. Nuestros estudios preliminares indican que las membranas de la cáscara pueden ser experimentalmente mineralizadas y pueden servir como nidos de nucleación de la deposición de cristales. El modelo se presenta mucho menos complejo que, por ejemplo, el hueso para estudios de biomineralización.

Por otro lado, el conocimiento básico de los procesos de mineralización en la cáscara del huevo no sólo podrá ser útil para la producción comercial de huevos sino que eventualmente para la elaboración de cerámicas de uso industrial según los principios biológicos ensayados por los seres vivos desde hace miles de años y dables de ser utilizados por el hombre del siglo 21.

Agradecimientos

A las facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias y a la Facultad de Ciencias de la Universidad de chile por autorizar nuestras Comisiones de Estudio, y al Dr. Arnald I. Caplan por otorgarnos todas las facilidades del Skeletal Research Center, Case Western Reserve University, para desarrollar este proyecto.

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