Introducción

Desde hace algunos años existe interés por la detección de quimioterápicos en alimentos de origen animal. Generalmente, se trata de residuos de antibióticos, sulfonamidas y otras substancias antibacterianas conocidas genéricamente como inhibidores.

En los países europeos, la inquietud por la detección de inhibidores bacterianos se basa en la necesidad de controlar el cumplimiento de las propias disposiciones legales destinadas a evitar la presencia de residuos en los alimentos y en la necesidad de control de alimentos importados de países ajenos a la Comunidad Europea (Levetzow, 1980).

Los antibióticos, sulfonamidas y otros inhibidores, se emplean con éxito en tratamientos terapéuticos o profilácticos de animales domésticos y también se ha difundido su uso como promotores del crecimiento de reses de abasto (Levetzow, 1980; Gedek und Hofmann, 1983).

Meyer, Jones et al. (1978) señalan que en Estados Unidos de N.A. prácticamente la totalidad de los animales destinados a carne, reciben productos quimioterápicos de algún tipo, notándose una tendencia franca a aumentar a través de los años.

Sin desconocer las características positivas de los quimioterápicos que desde su descubrimiento han tenido una decisiva participación en el tratamiento de enfermedades infecciosas tanto del hombre como de los animales, se han detectado algunos efectos negativos que parcialmente se presentan en pacientes tratados, pero ejercen esta acción en mucho mayor grado, cuando se encuentran como residuos en los alimentos. Esta ingesta incontrolada de inhibidores ha causado graves daños a la salud del hombre.

El paulatino aumento de bacterias resistentes a antibióticos presentes en el hombre, los animales y la naturaleza, se pueden atribuir en gran medida al uso indebido de antibióticos en tratamientos, o como promotores del crecimiento en alimentación animal.

La presencia de residuos de antibióticos en ciertos alimentos, causa graves daños tecnológicos en la elaboración de productos fermentados tales como yoghurt y salame, al inhibir la flora ácido láctica en cuyo desarrollo se basa la obtención del producto. Por este concepto se producen grandes pérdidas en la industria de alimentos (Meyer, Jones et al. 1978).

La alergia e hipersensibilidad de aproximadamente un 10% de la población a las penicilinas, que va desde una reacción cutánea al shock anafiláctico, se ve favorecida por la ingesta de bajas dosis de este fármaco a través de los alimentos. También las tetraciclinas provocan problemas al absorberse y unirse firmemente al Ca de los dientes y estructuras esqueléticas, inhibiendo el desarrollo de estos órganos. El cloramfenicol es conocido por provocar una anemia aplástica y granulocitopenia además de afección hepática, neuritis óptica y el llamado 'síndrome gris' de los recién nacidos (Meyer, Jones et al, 1978; Hapke, 1983).

Estos hechos han promovido la dictación de normas sobre el uso de inhibidores bacterianos en animales de carne, instaurando los 'tiempos de deplesión', vale decir fijando el lapso mínimo que debe transcurrir entre la aplicación del quimioterápico y la eliminación total del fármaco del organismo (Meyer Jones et al., 1978; Levetzow, 1980). Para poder controlar el cumplimiento de estas normas, surge la necesidad de desarrollar pruebas rápidas que permitan comprobar la inocuidad del alimento que se destina al consumo de la población.

Existe consenso sobre las bondades de las pruebas microbiológicas, basadas en la confrontación de una cepa sensible con la muestra problema, como prueba cualitativa de aproximación (screening-test). En el año 1973, aparece en Holanda la prueba del riñón en que emplean Micrococcus luteus como cepa sensible. Al año siguiente comienzan a probar, en Alemania Federal, las ventajas de una cepa de Bacillus subtilis que denominaron B.G.A. Este microorganismo denota gran sensibilidad frente a un amplio número de antibióticos. Surge paralelamente en varios países europeos la inquietud de adoptar y perfeccionar el método a fin de ampliar su espectro a una detención de niveles más bajos de Sulfonamidas y Cloranfenicol, que los logrados a la época, proponiendo el sistema de las cuatro placas que además del empleo de Micrococcus luteus y Bacillus subtilis B.G.A. incluye una cepa sensible de E. coli y dos niveles de pH (Levetzow, 1978; Nouws, 1981; Korkeala et al. 1982; Lindsay, 1983).

Sin embargo, considerando la conveniencia de hacer menos laborioso el método, continuaron las investigaciones en torno a Bacillus subtilis B.G.A. como cepa única a diferentes niveles de pH, para aumentar el espectro de captación de antibióticos y la adición de Trimetoprim para potenciar la acción de Sulfonamidas a fin de detectar niveles más bajos de estas substancias (Ebrecht, 1982; Hildebrandt et al. 1984).

En el año 1983, Alemania Federal fijó una técnica oficial para la detección de antibióticos en carne (Bundesgesundheitsamt, 1983) en que se concilian aspectos de aplicación práctica y seguridad diagnóstica y es probable que la misma se haga extensiva en el resto de los países de la Comunidad Europea.

Descripción de la técnica

1. Concepto. La detección de inhibidores con la técnica aquí descrita puede dar un resultado: positivo, negativo o sospechoso. No contempla la cuantificación ni la identificación de las substancias detectadas.

2. Resumen. Muestras de tejido muscular y renal se colocan sobre un medio de cultivo sólido que contiene una determinada cantidad de cultivo de una bacteria sensible a antibióticos. Los inhibidores difunden en el medio y provocan una zona de inhibición alrededor de las muestras. El tamaño del halo es una medida del efecto inhibidor.

3. Reactivos, cepas y sensidiscos.

3.1 Medio de cultivo:

Para preparar el substrato se usa un medio de cultivo deshidratado de la siguiente composición:

Peptona de carne

3,45 g

Peptona de caseína

3,45 g

Na Cl

5,10 g

Agar

13,00 g

Agua destilada

1000,00 ml

El medio de cultivo se disuelve en agua destilada y se le agrega 0,1 % de KH2PO4. El pH se ajusta con HCI o NaOH y su valor debe controlarse después de autoclavel medio de cultivo.

Para preparar el medio de cultivo para la prueba de inhibidores, se mezclan 500 ml del medio líquido enfriado a 50ºC con 0,5 ml de una suspensión de esporas de la cepa, bajo agitación regular. Al medio ajustado a pH 7,2 se agregan, además, 0,5 ml de una solución de Trimetoprim que se prepara según 3.2. La mezcla se deposita en placas de Petri de modo que al solidificar, se obtenga una capa de 2 mm de altura. Las placas preparadas se guardan en refrigeración hasta el momento de su uso. Se recomienda usar los medios dentro de 2 días posteriores a su preparación.

3.2 Solución de Trimetoprim (TMP):

10 mg de TMP se disuelven en 10 ml de etanol bajo agitación y calentado a 50°C (solución madre). Esta solución almacenada en frío y oscuridad, dura varios meses. Agregando 190 ml de agua destilada estéril, la solución se lleva a una concentración de 50 mcg de TMP ml (solución de uso). Esta solución almacenada en refrigerador dura a lo menos 15 días.

3.3 Cepa bacteriana:

Como cepa bacteriana debe usarse Bacillus subtilis B.G.A. que se obtiene en el Instituto de Medicina Veterinaria (Robert von Ostertag) del 'Bundesgesundheitsamt', 1.000 Berlin 33, Alemania Federal, o bien en el comercio especializado.

3.4. Suspensión de esporas:

Un medio de cultivo con la composición descrita en 3.1 se ajusta a pH 7,0 ± 0,2, se siembra abundantemente con la cepa descrita en 3.3 y se incuba por 10 días a 30ºC. Luego se cosecha la cepa con solución salina fisiológica estéril. Este producto se centrifuga por 10 min. a 3.000 RPM, se desecha el sobrenadante y se agrega nuevamente solución salina estéril al sedimento, volviendo a centrifugar en las condiciones antes señaladas. Después de retirar el sobrenadante se agrega solución salina estéril y se calienta la suspensión por 30 min. a 70ºC. Esta suspensión de esporas se ajusta a una concentración de 107 esporas/ml y se guarda en refrigeración pudiendo durar varias semanas. La comprobación de la concentración se realiza por recuento bacteriano en superficie empleando el mismo medio de cultivo mencionado en 3.1.

3.5 Sensidiscos:

Se emplean sensidiscos comerciales de Penicilina G. 0,01 U.I (medio a pH 6,0); Estreptomicina, 0,5 mcg (medio a pH 8,0) y Sulfadimidina 0,5 mcg (medio a pH 7,2) con un diámetro de 6 mm.

4. Equipos y accesorios.

4.1 Sacabocados, pinza, tijera. 4.2 Lupa o microscopio estereoscópico con una instalación para determinar el tamaño del halo. 4.3 Estufa de cultivo, + 30°C.

5. Toma de muestra:

Para la detección de inhibidores se toman las siguientes muestras:

5.1 De un cuarto anterior o posterior en lo posible un músculo completo recubierto de fascias o como sustituto un cubo muscular de aproximadamente 6 cm de lado.

5.2 Un riñón.

Las muestras se toman con material estéril y se someten de inmediato a refrigeración. El eventual transporte para envío a laboratorio también debe hacerse en ambiente frío.

6. Examen. De la musculatura y del riñón se obtienen con sacabocados 3 trozos cilíndricos de tejido con un diámetro de 8 mm. y una altura de 2 mm. Un trozo de cada tipo de tejido se coloca sobre el medio de cultivo a pH 6,0; pH 8,0 y pH 7,2 respectivamente (fig. 1). El material altamente contaminado es inadecuado para la detección de inhibidores.

Los medios de cultivo se incuban por 18-24 horas a 30ºC. Sobre un medio de cultivo de pH 6,0 se coloca un sensidisco de 0,01 U.I. de Penicilina G; sobre un medio a pH 8,0 un sensidisco con 0,5 mcg de Estreptomicina y en un medio con pH 7,2 un sensidisco con 0,5 mcg de Sulfadimidina. Estos medios se incuban simultáneamente como controles.

Fig. 1.  Sensidisco y trozos de tejidos depositados sobre el substrato de cultivo a tres niveles de pH. M = músculo; R = riñón, p = penicilina; s = sulfadimidina; e = estreptomicina.

7. Evaluación. Se mide el halo entre borde del tejido y límite de crecimiento (fig. 2). En casos dudosos se recurre a la lupa o a un microscopio.

8. Informe. Una inhibición clara y total del crecimiento de a lo menos 2 mm, se considera positiva; una de 1-2 mm sospechosa cuando los controles paralelos han denotado un halo de inhibición perfecto de un tamaño cercano a 6 mm. En el informe debe señalarse el tipo de tejido y el resultado como positivo, negativo o sospechoso.

Fig. 2. Determinación del tamaño del halo de inhibición formado alrededor del trozo de tejido

Niveles de la tolerancia

Existen varios criterios para fijar los niveles de tolerancia de los residuos de quimioterápicos en alimentos. Uno de ellos se basa en la determinación del nivel de nulo efecto. Otra forma sería fijar tolerancia cero, especialmente para aquellos productos que se emplean en terapia humana. Esta posición que en principio puede ser la ideal, tiene por inconveniente el hecho de que no existiría técnica capaz de detectar niveles tan bajos o iguales a cero. Por otra parte, no siempre se justifica, puesto que existen quimioterápicos como lo son las tetraciclinas que si bien tienen la capacidad de acumularse en el tejido óseo, su presencia en músculo es muy baja además de ser absorbida en forma incompleta a nivel de tracto gastrointestinal (Nouws, 1981).

Los niveles de tolerancia que han sido propuestos o fijados por algunas instancias, quedan cubiertos en su mayoría por la sensibilidad de la técnica microbiológica del Bacillus subtilis BGA. Es por ello que Nouws (1981) sugiere fijar límites de tolerancia considerando la sensibilidad de esta técnica que por sus bondades se presta para la aplicación rutinaria.

De una sensibilidad significativamente mayor resultan las pruebas físico-químicas de detección de inhibidores de carne: Al respecto se han descrito diversas formas de identificación de Cloranfenicol y de Sulfonamidas, empleando de preferencia la cromatografía en capa fina, la cromatología de líquido de alta presión y el radioinmunoensayo (Jonas et al. 1983; Schlatterer, 1983; Petz, 1983; Arnold et al. 1984; Aghte, 1984).

Si bien como estos métodos se pesquisan con pequeñas dosis de estos inhibidores, tienen un alto costo de aplicación, motivo por el cual siendo muy útiles para la identificación de los fármacos, se hace impracticable su uso en los análisis de rutina.

Consideraciones generales

La detección de residuos de antibióticos se justifica plenamente en el caso de faenamiento de animales afectados por alguna patología (matanza de urgencia), por las altas probabilidades que existen de haber sido tratados con quimioterápicos.

Por otra parte, aparecen de mayor riesgo aquellos animales destinados a carne que han sido sometidos a crianza intensiva, dado que en ellos frecuentemente se suministran quimioterápicos como promotores del crecimiento. En nuestro medio, esta modalidad de producción se presenta de preferencia en cerdos y aves, debido a que en bovinos y ovinos predomina el sistema de crianza extensiva.

El criterio de decomiso frente a la presencia de residuos de antibióticos, que impera en la RFA, es el de eliminación total de la canal sólo cuando se pesquisan halos de inhibición en las muestras de músculo, disponiéndose el decomiso de los órganos de la res, cuando el inhibidor se presenta únicamente en el tejido renal. Para el caso de aves, aún no disponen de un método oficial y por ende no se han fijado los criterios de decomiso. Sin embargo parece factible aplicar la misma técnica, faltando por decidir sobre el tipo de tejido a obtener como muestra.

Al disponer de una técnica de diagnóstico de residuos de inhibidores en carne, se abre la posibilidad de ampliar el control de inocuidad de los alimentos, minimizando los efectos negativos a que esto conlleva.

Una legislación sobre el uso de antimicrobianos para diversos fines será eficiente sólo al disponer de un mecanismo que permita controlar el cumplimiento de las normas.

Para los fines antes señalados, el método microbiológico de Bacillus subtilis BGA es una buena alternativa que concilia la sensibilidad, con el costo y facilidad de aplicación. Resulta, por lo tanto, ser un método eficiente para aplicarlo como control de rutina para detectar presencia o ausencia de inhibidores bacterianos.

Bibliografía

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