Introducción

Biotecnología es un término relativamente nuevo acuñado en la década pasada para describir un conjunto de técnicas que, mediante la manipulación del material genético, son capaces de modificar el genoma de un organismo a voluntad. Aunque su aceptación más restringida suele referirse a la técnica que usan ácido desoxiribonucleico (ADN) recombinante, también pueden incluirse en él otros procesos que no siendo nuevos, como la fermentación, la manipulación de embriones y la fabricación de vacunas, resultan novedosos al ser asociados a procedimientos que alteran o seleccionan el genoma. La gran mayoría de estos procedimientos tecnológicos se han generado como subproducto de tecnologías y metodologías experimentales diseñadas para someter a prueba hipótesis formuladas a propósito de fenómenos fundamentales de la biología celular y molecular.

Bases moleculares de la biotecnología

Los fundamentos de la biotecnología nacen cuando Avery y sus colegas en 1944, establecen que el ADN constituye la base de la herencia. Posteriormente en 1953, se establece la tan esperada unión entre la bioquímica y la genética con el descubrimiento de la estructura de doble hélice de la molécula de ADN por Watson y Crick.

El ADN celular consiste en una doble hebra de pares de nucleótidos (A=adenina, T= timina, G=guanidina, C=citocina), organizados secuencialmente como nucleótidos. Las moléculas de ADN del núcleo de una célula eucariótica, que constituyen parte de los cromosomas, son extremadamente largas. en el sentido que contienen cientos de miles de pares de nucleótidos en una secuencia lineal. La secuencia de los pares de bases en los nucleótidos es la responsable de la información genética que se encuentra codificada por una combinación de tres pares de bases conocidas como triplete. El ensamblaje de cada uno de los 20 aminoácidos para formar una cadena polipéptidica está codificada por al menos un triplete de bases del ADN. De esta   manera el orden lineal de los tripletes en el ADN determina las secuencias de aminoácidos para la producción   de proteínas específicas. La formación de una proteína requiere la lectura de la información genética contenida en la molécula de   ADN para la formación complementaria de ARN mensajero en un proceso llamado transcripción, el que luego de procesado, es leído en el ribosoma determinando el ensamblaje de los aminoácidos correspondientes en un proceso llamado de traducción.

Algunos virus (Retrovirus) presentan una enzima (transcriptasa reversa) que permite obtener copias de ADN a partir de ARN, de esta manera se puede obtener ADN clonado a partir de la información contenida en el ARN.

No obstante en las células animales, no todo el ADN se está transcribiendo continuamente y no siempre son los mismos segmentos de ADN los que se transcriben. De hecho los distintos tipos diferenciados de células transcriben particulares . segmentos del mismo ADN del individuo. Así por ejemplo, el inicio de la pubertad está gatillado por la transcripción de segmentos del ADN responsables de la producción de determinadas hormonas. De manera similar la producción de hormona del crecimiento (Somatotrofina) se inicia y es controlada por la transcripción de un segmento apropiado del ADN conocido como el gen de la somatotrofina. Así, entonces el término gen se usa para describir algún segmento del ADN que es responsable de una función específica en el organismo y que está involucrado como una unidad discreta en el proceso de segregación y recombinación cuando se forman las células germinales.

Es en la década de 1970 en que nace la técnica del ADN recombinante. El ADN recombinante simplemente consiste en aislar un trozo determinado del ADN de una célula, transferirlo a un vector in vitro y luego insertarlo en otra célula. El resultado es la obtención de una célula transgénica.

Es a partir de la década pasada que se aisla del orden de un centenar de enzimas capaces de escindir y volver a ligar la molécula de ADN en sitios particulares, conocidas como enzimas de restricción y ligasas respectivamente. Premunidos de estas verdaderas tijeras moleculares se pueden obtener segmentos precisos de ADN (genes) que codifican para determinadas proteínas. Por otra parte, es posible obtener ADN a partir de ARN mediante el uso de transcriptasa reversa.

Por otra parte, las células procariontes, especialmente bacterias, presentan conjuntamente con su ADN cromosómico en forma de una doble hélice circular, un número variable de pequeños trozos circulares de ADN extracromosómico conocidos como plasmidios. Estos plasmidios pueden ser aislados de las bacterias, su ADN puede ser modificado por inserción o sustitución con ADN extraño y luego pueden ser reincorporados a bacterias. De esta manera, la célula bacteriana puede sintetizar un producto nuevo y en grandes cantidades dada la gran velocidad de multiplicación del microorganismo lo que disminuye los costos de producción muy por debajo de los métodos clásicos de obtención (Fig. 1)

FIGURA Nº1 ADN RECOMBINANTE

Como se puede ver el éxito del uso del ADN recombinante en el mejoramiento animal dependerá de la identificación del segmento apropiado del ADN (gen), su aislamiento desde la célula y su reintroducción en otra célula en un lugar apropiado.

Desde el punto de vista de su utilidad en Medicina Veterinaria, ya sea en salud, producción animal y preservación de fauna silvestre, los principales procedimientos biotecnológicos pueden dividirse en dos grupos:

a) Modificación de células procarióticas b) Modificación de células eucarióticas

Modificación de células procarioticas

Es en este campo donde la Biotecnología (llamada también Ingeniería Genética) está más desarrollada y consiste simplificadamente en aislar un trozo de ADN de una célula eucariótica que codifique para una proteína de interés (v. gr. insulina, somatotrofina), e insertarlo en ADN plasmidial y luego reincorporar este plasmidio modificado en el citoplasma bacteriano (Fig. 1). Mediante esta tecnología se ha podido producir somatotrofina de diverso origen de modo de mejorar el crecimiento y producción láctea en diversos animales domésticos. Richard y colaboradores (1985) reportan un aumento de 12% en la producción de vacas lecheras y sobre un 25% de aumento en la grasa láctea, sin aumento del consumo de alimento, por efecto de la administración diaria de somatotrofina exógena.

Otra aplicación de esta metodología es en la producción de vacunas (Fig. 2). En este sentido son numerosos los intentos para desarrollar mediante biotecnología, nuevas y más efectivas vacunas contra fiebre aftosa, lengua azul, rinderpest, rinotraqueitis infecciosa, estomatitis vesicular y contra agentes parásitos metazoarios.

FIGURA Nº2 PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOSS MONOCLONALES

El procedimiento es esencialmente similar y consiste en el aislamiento de aquel segmento del ADN o ARN del parásito viral o metazoarios que codifica para un determinante antigénico de su superficie, insertarlo en un plasmidio, reincorporar este plasmidio en bacterias, y producir así grandes cantidades del antígeno. De esta manera se inyecta al animal solamente el determinante antigénico activo sin el resto del virus o del parásito eucariótico obviando su potencial patogenicidad y aumentando su eficacia. El modo de reconocer inequívocamente tal antígeno particular es mediante la generación de un anticuerpo monoclonal específico (vide infra).

Es así como de las cuatro proteínas de superficie del virus de la fiebre aftosa (VP1, VP2, VP3, VP4), la fracción VP, es la responsable de la antigenicidad, Kleid y colaboradores han donado el gen para la proteína VP1 del virus tipo A. Este gen fue luego insertado en E. coli, y producido el antígeno a mayor escala. Sin embargo la eficacia obtenida hasta el momento es menor que la del virus completo posiblemente por la falta de adyuvantes apropiados, o por obtener la proteína antigénica con una conformación inadecuada.

Aunque no constituya un procedimiento propiamente biotecnológico convendría hacer notar que también ha sido posible producir antígenos mediante la síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, 1964) lo que permite generar químicamente polipéptidos de alrededor de 50 aminoácidos.

Originalmente no fue fácil determinar la secuencia de aminoácidos de las pequeñas proteínas virales. Sin embargo, con el desarrollo de la técnica de ADN recombinante ha sido posible donar el gen que codifica para tales proteínas y de esta manera el gen puede ser secuenciado (determinar el orden de sus nucleótidos). Conocido así el orden de los tripletes de nucleótidos se puede conocer la correspondencia con el orden de los aminoácidos (GTC=valina, CCC= prolina).

Es así como diversos autores en Inglaterra y EE.UU. han sintetizado diversos péptidos a partir del conocimiento de la secuencia de 213 aminoácidos del virus tipo O de la fiebre aftosa. De ellos se ha visto que sólo las regiones 141 - 160 - 161 - 180 y 201 - 213 presentan antigenicidad induciendo niveles significativos de anticuerpos seroneutralizantes (Bittle et al, 1982). Dado que existen 7 serotipos y más de 60 subtipos del virus de la fiebre aftosa, y que estos virus tienen la capacidad de generar mutantes que escapan al sistema inmune, resulta necesario estudiar cuales modificaciones moleculares son las responsables de este bajo rendimiento antigénico. Así, Rowlands y colaboradores (1983) han observado que el cambio en uno o dos aminoácidos del determinante antigénico (región 141 - 160) del virus A12,   específicamente en la posición 148 y 153 genera variantes que son pobremente neutralizadas.

Considerando que el rendimiento antigénico de la inoculación de determinantes antigénicos puros no ha sido aún del todo satisfactoria, se ha generado una variante metodológica que consiste en producir una vacuna vectorizada por otro virus (ej. virus vacuna Moss et al, 1988). Simplificadamente, ésta consiste en introducir ADN recombinante, por ejemplo del virus de la fiebre aftosa en el virus vacuna. Este virus induce tanto inmunidad celular como humoral.

El virus vacuna es capaz de transportar más de 25 kilobases de ADN extraño con lo que se pueden codificar muchas proteínas. Este virus es altamente inmunogénico, no riesgoso para la salud y adicionalmente resulta altamente estable manteniendo su potencia luego de su exposición a temperatura ambiente a lo largo de meses.

No resulta difícil visualizar entonces el desarrollo futuro de vacunas vectorizadas por el virus vacuna que contengan genes para 10 ó más antígenos de los más importantes virus que generan enfermedades en los animales domésticos.

Una tercera aplicación de la modificación del genoma de células procarióticas en medicina veterinaria, específicamente en la producción animal, dice relación con el mejoramiento de la nutrición de rumiantes mediante la modificación del ecosistema ruminal. Aunque apunta en este campo la información es escasa, ya que, por ejemplo no se conoce bien el mapeo del genoma bacteriano que se expresa en la producción de enzimas específicas (v. gr. celulasas), o en las vías metabólicas que están bajo el control del ADN, claramente es dable esperar un notable avance en los próximos años. Se podría aumentar la producción de celulasas en los microorganismos ruminales o, mediante la adición a los forrajes de microorganismos transgénicos se podría promover una mayor palatabilidad y digestabilidad de la fibra. Esto resulta especialmente importante en los países de vías de desarrollo, en los cuales los alimentos para rumiantes poseen altos contenidos de celulosa. También se podría incorporar al genoma de microorganismos ruminales, genes provenientes de microorganismos saprófitos que estén involucrados en la degradación de compuestos no digeribles (v. gr. lignina).

Junto con lo anterior, la aplicación de la biotecnología en las prácticas agronómica, especialmente mediante la incorporación de variedades de plantas tas transgénicas como fuente de alimentos para animales, resultará de gran valor para aumentar la productividad de la ganadería.

Por otro lado, también mediante procedimientos similares, se ha podido aumentar la capacidad fermentadora de los productos lácteos de algunos microorganismos, lo que podría tener un profundo impacto en la industria de alimentos. Es así como se ha aislado y fragmentado el plasmidio pL H 2001, que es esencial para la fermentación de la lactosa, proveniente del Streptococcus lactis (Harlander et al, 1985). La reinsección de estos fragmentos genómicos en bacterias podría aumentar la eficiencia de la fermentación de los productos lácteos.

Por último no se ve lejano el día en que la modificación de la resistencia a determinados antibióticos, que en la mayoría de los microorganismos radica en el genoma plasmidial, sea utilizada para aumentar la eficiencia terapéutica de ciertos medicamentos. Así también será posible biosintetizar nuevos y más eficientes antibióticos.

Hasta aquí hemos analizado algunas de las diversas posibilidades que puede tener la biotecnología en la modificación del genoma animal. Sin embargo, debemos detenernos algo más en el análisis. Una buena recopilación de aspectos básicos y aplicados de esta materia puede encontrarse en Brackett y colaboradores (1981). Centraremos así nuestra atención en la manipulación de embriones más que en la modificación de células de la línea germinal por estar esto último menos desarrollado.

En mamíferos luego de la fecundación y por la acción del espermatozoide el cigoto formado comienza una serie de divisiones mitóticas sucesivas en un proceso llamado segmentación (fig. 3), del que resultan embriones de 2, 4, 8 y 16 células (blastómeros) totipotentes rodeados de una zona pelúcida. Zonas pelúcidas vacías se pueden aislar y conservar fácilmente.

Producción de gemelos

Un primer tipo de manipulación, que incluso ocurre naturalmente, es la obtención de gemelos idénticos mediante la separación de los primeros blastómeros y su transferencia en forma separada a dos madres receptoras. Pero, esto ha ido más allá, puesto que actualmente es posible tener una viabilidad apreciable al obtener al menos partos trigemelares a partir de la transferencia de los cuatro primeros blastómeros. Varios grupos de investigadores se encuentran ensayando la transferencia por separado de blastómeros aislados de embriones de 8 células con el fin, incluso, de poder sexarlos. Actualmente, se estudian métodos no cruentos para determinar el sexo mediante la verificación de la presencia de un producto diferencial de las células XX o XY, ya que hasta hoy sólo es posible determinar el sexo destruyendo algún blastómero para analizar su cariotipo. Luego de conocido su sexo, se pretende transferir sólo algunos de los blastómeros y congelar el resto de las células gemelas hasta analizar su real potencial productivo (Arias, 1987). Estas micromanipulaciones también tienen mucha utilidad en el estudio de aspectos fundamentales del desarrollo (Fernández e Izquierdo, 1980).

Si a esto se une la posibilidad de modificar el genoma por ADN recombinante en estos estados tempranos del desarrollo se apreciará claramente su enorme utilidad.

Clonaje por homocigosis

En algunas especies animales (pavos, peces, etc.) este mecanismo ocurre naturalmente mediante la partenogénesis. Aunque no en todas las especies ocurre de modo similar, el resultado final es la generación de individuos sin la participación del sexo opuesto. No se ha descrito, sin embargo, la presencia natural de este mecanismo en los mamíferos.

Un mecanismo artificial para producir individuos diploides homocigotos consiste en extraer el pronúcleo masculino luego de la etapa no síntesis del ADN posteriormente a la fecundación (Fig. 3) realizada in vitro en presencia de citochalasina B. La citochalasina B, se une a un extremo de los filamentos de actina impidiendo su polimerización y no en este caso impide la citodiéresis (división del citoplasma), no interfiriendo con la separación cromosómica durante la mitosis. De esta manera se obtiene en una primera etapa una célula binucleada con una dotación haploide del genoma femenino en cada núcleo. Al sacar esta célula del medio que contiene la droga se verifica una segunda síntesis de ADN, la que genera un genoma diploide en cada uno de los núcleos de la célula binucleada la que luego de su división mitótica completa genera dos células uninucleadas que poseen el mismo genotipo contenido en el pronúcleo femenino del cigoto original. Una vez transferidas adecuadamente en madres receptoras, estas células podrían, teóricamente, dar origen a individuos diploides homocigotos. Este procedimiento teórico no ha podido ser realizado hasta ahora, ya que se requiere algún mecanismo no caracterizado de interacción entre los gametos de distinto sexo.

FIGURA 3 ALGUNAS ETAPAS DEL DESARROLLO PREIMPLANTACIONAL DE MAMIFEROS Y MÉTODO DE INYECCIÓN DE GENES O ASPIRACIÓN DE PRONUCLEOS

Otra forma teórica de obtener diploides homocigotos a manera de verdaderos individuos clonados, se generó a partir de las experiencias de Gurdon (1968) quién fue capaz de obtener desarrollo de individuos adultos a partir de la inoculación de núcleos diploides provenientes de células somáticas (intestino de larvas de anfibios) en óvulos enucleados por irradiación UV.

En este sentido, la idea de clonar por ejemplo, un macho reproductor de óptima calidad para obtener docenas de individuos iguales, es sin duda un gran anhelo comparable con el cofre de Pandora. La dificultad radica sin embargo, en la diferenciación irreversible del genoma durante el desarrollo, por lo que hoy no resulta posible obtener en mamíferos clones a partir de la inoculación del núcleo de células somáticas adultas en óvulos enucleados.

No obstante es posible, obtener clones de la fusión de blastómeros (hasta de estado de 16 células) con óvulos no fecundados a los que se les ha extraído el pronúcleo (citoplasto) o que se han obtenido en forma enucleada por separación del óvulo en dos fracciones una pequeña conteniendo el pronúcleo y la otra sólo citoplasma (Prather et al. 1987; Marx, 1988). De esta manera se podría mejorar la eficiencia en la obtención de gemelos a partir de embriones de hasta 16 o más células, cuestión que no ha podido hacerse por la simple separación de ellos y posterior transferencia a madres receptoras (vida supra).

Superados los problemas tecnológicos y de conocimientos básicos que permitan la producción de estos Individuos a gran escala, estas biotecnologías tendrían múltiples usos y ventajas a saber:

1.- Eliminación de la variación genética en los experimentos. 2.- Rápida producción de líneas consanguíneas. 3.- Generar individuos con notables características genotípicas con el fin de dejarlos para reproducción. 4.- Generar individuos con notables características fenotípicas para producción. 5.- Producción rápida de líneas con caracteres especiales (v. gr. madres melliceras). 6.- Selección automática del sexo.

Formación de quimeras

Otra manera de generar individuos con genomas parcialmente modificados es la introducción de ADN recombinante en sólo algunas células del embrión o la introducción de células provenientes de otro embrión (de la misma o de otra especie) entre las células del macizo celular interno (embrioblasto) de un blastocisto. Simplificadamente consiste en introducir células de macizo celular interno de un embrión en la cavidad blastocélica de otro embrión. El blastocisto así modificado es transferido a una madre nodriza y se obtiene un individuo con células mezcladas de distinto genoma, es decir algunas células de sus tejidos tendrán el genoma del embrión del blastocisto original y otras, de las células introducidas. Este individuo es conocido como una Quimera, en referencia a la estatua de bronce etrusca (500 A.C.) que representa un león de cuyo dorso emerge una cabeza de cabra y cuya cola es una serpiente, que se encuentra actualmente en el Museo Arqueológico de Florencia. (fig. 4)

FIGURA Nº4 QUIMERA ETRUSCA (500 A.C.)

De esta manera se podría por ejemplo, introducir células de macizo celular interno de cabra en un blastocisto de oveja al que se le ha eliminado su embrioblasto. Luego al ser transferido a una oveja receptora ésta daría origen a una cabra. Actualmente se han generado quimeras, por ejemplo, entre dos razas de bovino (Brauvieh + Hosltein Friesian) y entre razas de ovinos.

Los animales así generados no poseen actualmente una gran utilidad en los sistemas de producción animal especialmente porque a su descendencia pasa el genoma de uno de sus padres. Sin embargo podrían ser de utilidad en la investigación de la transmisibilidad de algunas características cuantitativas.

Una de las formas de introducir ADN en las células eucarióticas, que no posee las dificultades tecnológicas del uso de ADN recombinante, consiste en la fusión de células eucarióticas con microcélulas. Estas microcélulas se obtienen tratando células con colchicina con lo que se detienen en metafase. El tratamiento subsecuente con citochalasina y centrifugación permite producir microcélulas que poseen sólo algunos pocos cromosomas y una pequeña cantidad de citoplasma rodeado de membrana celular. Una variante de esto es tratar las células con citochalasina y centrifugación con lo que se generan minicélulas, las que poseen su dotación cromosómica completa pero escaso citoplasma.

Otro vehículo utilizado para introducir cromosomas en otras células consiste en la obtención de cromosomas específicos mediante colchicina y posterior disrrupción de la célula. Estos cromosomas así obtenidos pueden ser incluidos en liposomas y de esta manera ser transferidos a la célula intacta.

Conclusiones

Durante la historia de las ciencias agropecuarias el mejoramiento animal se ha logrado por un proceso lento de selección genética o por el tratamiento de los animales con agentes exógenos que mejoran su eficiencia (vacuna, drogas, hormonas, etc.).

La emergencia de las biotecnologías en esta década y su explosivo desarrollo, sin duda hará posible la alteración genética inmediata, directa y controlada de los animales, así como también permitirá la producción de agentes exógenos altamente específicos, con escasos efectos colaterales y de bajo costo, los que tendrán un importante efecto en el aumento del rendimiento productivo de los animales y en la eficacia de la prevención, diagnóstico y tratamiento de las alteraciones patológicas que afectan a la masa ganadera.

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