Introducción

La erisipela porcina ocupa un lugar importante entre las causales de pérdidas económicas dentro de la industria porcina nacional.

Además de los casos agudos, la prevalencia de cerdos portadores de Erysipelothrix rhusiopathiae a nivel tonsilar indica niveles bastante elevados que alcanzan valores de 31 % a 53,3% (Díaz y col., 1980; Urcelay y col., 1980; Skoknic y col., 1981).

En mataderos, se ha encontrado que rhusiopathiae participa en un 69% de las lesiones articulares (Alegría y col., 1984).

Los estudios nacionales de serotipificación de cepas aisladas de cerdos, ya sea de portadores, de lesiones artríticas o de casos agudos, han encontrado que los serotipos de mayor frecuencia, no han sido los mismos descritos en otros países; más aún un serotipo nuevo, no descrito anteriormente, se ha presentado con relativa frecuencia (Sánchez y col., 1989; Sánchez y col., 1991). La mayoría de las vacunas utilizadas en nuestro país, para la protección frente erisipela porcina, son bacterinas preparadas en el extranjero y los resultados de su uso masivo han sido satisfactorios respecto a la aparición de cuadros agudos. Sin embargo, no existen antecedentes del grado de protección que puedan inducir frente a casos crónicos de la enfermedad.

Sobre la base de los antecedentes presentados, fue nuestro interés conocer si las vacunas en uso protegen adecuadamente frente a la infección por los serotipos aislados en Chile, sean los que producen compromisos artríticos o los que se encuentran en portadores aparentemente sanos.

 

Material y métodos

MATERIAL

A.– Se seleccionaron tres de las vacunas comerciales de mayor uso en el país, según número de dosis anuales declaradas y vendidas; fueron identificadas como vacunas A, B, y C. Cada una de ellas se empleó en dosis de 0,25 y 0,50 ml, vía sub–cutánea.

B.– Se utilizaron ratones cepa CF–1, de 14 a 16 g de peso, provenientes del Instituto de Salud Pública de Chile.

C.– Se seleccionaron cuatro cepas de E. rhusiopathiae aisladas de cerdos del país y de dos orígenes diferentes, correspondientes a los serotipos de más alta frecuencia detectados por Sánchez y col. (1986,a,b) a la fecha de inicio de este estudio (ver Tabla).

Cepa

Origen

Serotipo

Frecuencia

6759

Tonsilar

2

44.40%

5858

Tonsilar

19

20.00%

 17S

Artritis

10

21.70%

 33B

Artritis

14

21.70%

Previo a la experiencia, se comprobó el rol patógeno para el ratón de cada una de estas cepas, mediante inoculación vía intraperitoneal y/o escarificación auricular. Aquellas cepas cuya virulencia se consideró insuficiente para el ensayo, debido a sus sucesivos subcultivos, fueron reactivadas a través de pasajes en ratón y huevos embrionados. Se calculó para el ratón, por inoculación intraperitoneal de diluciones seriadas de suspensiones bacterianas, la dosis mínima letal (DM) de cada cepa, observando los efectos producidos en un período de 10 días.

MÉTODOS

Se realizó el estudio de protección de estas vacunas, a través de un modelo de ratones, desafiando con cada una de las cepas de los serotipos seleccionados. Para ello se diseñó un esquema particular de inmunización, considerando recomendaciones tanto del British Veterinary Codex (1965) como del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA/APHIS, 1982).

Se estableció un esquema de protección por separado para cada una de las vacunas, frente a cada cepa de los cuatro serotipos. Para ello fueron vacunados un número suficiente de ratones, con el fin de tener al momento del desafio la posibilidad de conformar grupos homogéneos previniendo las mermas por las posibles muertes que podrían ocurrir post–vacunación.

Previo al desafío y para cada vacuna y serotipo se formaron dos grupos de 12 ratones cada uno, correspondientes a las dos dosis de vacuna utilizadas.

Para cada una de las cuatro cepas de desafío se consideró un grupo testigo D, constituído por 10 ratones. Los otros grupos de animales fueron: un control E con 10 ratones, que recibió al momento del desafío un placebo de 1 ml de solución fisiológica vía intraperitoneal; para comprobar la inocuidad de la vía y el vehículo de éste y el grupo control F, con 10 ratones, para comprobar la posible presencia de E. rhusiopathiae en forma natural en los ratones y/o en el ambiente.

A los 21 días post–vacunación los ratones de los grupos vacunados y sus respectivos grupos testigos, fueron inoculados vía intraperitoneal con 20 DML de cada una de las cepas de desafío.

Los animales en estudio fueron observados diariamente, contabilizándose las muertes por un período de 10 días.

Se comprobó la presencia de E. rhusiophatiae en los ratones muertos, mediante frotes teñidos con Gram, de bazo y sangre de corazón. Igualmente se realizaron cultivos en agar nutritivo con 10% de sangre ovina para corroborar desarrollo de colonias típicas de E. rhusiopathiae.

Los resultados fueron sometidos a un análisis estadístico por prueba de diferencia de proporciones de animales muertos a través de la distribución de X2 (Snedecor y Cochran, 1964).

Resultados

El número de ratones muertos en cada grupo fue un indicador de la protección otorgada por la vacuna y se convino que la vacuna se consideraría Buena aceptando una sola muerte; Suficiente cuando ocurrían 2 ó 3 muertes y Mala cuando ocurrían 4 6 más muertes, considerando que los grupos vacunados estaban formados en su mayoría por 11 ó 12 ratones.

Los resultados de protección frente a erisipela, en ratones inyectados con las vacunas comerciales A,B y C, se presentan en los Cuadros 1, 2, 3 y 4, según las cepas de los serotipos de E. rhusiopathiae con que se realizo el desafío. Ningún animal de los grupos controles E y F resultó muerto durante la experiencia.

Respecto a la protección conferida frente a la cepa del serotipo 2, las proporciones de muertes entre los grupos vacunados y testigo, muestran diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05) para las tres vacunas. La protección conferida frente a este serotipo, se considera Buena para todas las vacunas, independiente de la dosis utilizada.

La respuesta frente al desafío con la cepa del serotipo 19, entrega también proporciones con diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05). La protección conferida frente a este serotipo se consideró Buena para la vacuna A; Suficiente para la vacuna B; Buena en dosis de 0.50 ml y Suficiente en dosis de 0.25 ml para la vacuna C.

La respuesta frente al desafío con la cepa del serotipo 10, indica que en el Grupo Testigo de la vacuna A sólo hubo 4 animales muertos y la proporción de muertos entre este grupo y los vacunados no mostró diferencias estadísticamente significativas (p>0.05), no pudiéndose calificar en este caso la protección. Para la vacuna B hubo diferencias estadísticamente significativas  (p < 0.05) respecto de la dosis de 0.25 ml, no así para la dosis mayor.  La vacuna C, no demostró diferencias estadistícamente significativas  (p < 0.05)   entre las proporciones de muertes de los grupos vacunados y testigo para ninguna de las dosis empleadas. La protección conferida frente al serotipo 10 por la vacuna B, fue Mala con la dosis de 0.50 ml y Suficiente con la dosis de 0.25 ml; la protección fue Mala frente alas dos dosis de la vacuna C.

   CUADRO 1 Protección de ratones con vacunas comerciales, frete al desafio con E. rhusiopathiae serotipo 2

Grupo

Vacuna A

Vacuna B

Vacuna C

muertos

muertos

muertos

Vacunado con 0. 50 ml

11

0

11

0

11

1

Vacunado con 0. 25 ml

12

0

11

0

12

0

Testigo

10

10

10

10

12

10

CUADRO 2 Protección de ratones con vacunas comerciales,frente al desafio con E. rhusiopathiae serotipo 19

Grupo-- Vacuna A Vacuna B Vacuna C
muertos

muertos

muertos

Vacunado con 0.50 ml 12 0 12 3 11 0

Vacunado con 0.25 ml

12

0

12

3

12

3

testigo

10

9

10

9

10

9

CUADRO 3 Protección de ratones con vacunas comerciales,frente al desafiocon E. rhusiopathiae serotipo 10 

Grupo-- Vacuna A Vacuna B Vacuna C
muertos

muertos

muertos

Vacunado con 0.50 ml 12 1 12 8 12 8

Vacunado con 0.25 ml

12

0

12

3

12

6

testigo

10

4

10

8

10

8

CUADRO 4  Protección de ratones con vacunas comerciales, frente al desafio con E. rhusiopathiae serotipo 14

Grupo

Vacuna A

Vacuna B

Vacuna C

muertes

muertes

muertes

Vacunado con 0. 50 ml

11

0

11

3

12

2

Vacunado con 0. 25 ml

12

0

11

0

12

7

Testigo

10

10

10

10

10

10

El estudio de protección frente al desafío con la cepa del serotipo 14 entrega proporciones de muertes entre los grupos vacunados y testigo para las vacunas A y B, que muestran diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05). Lo mismo ocurre sólo para la dosis mayor (0.50 ml) de la vacuna C. La protección conferida frente al serotipo 14 por la vacuna A se considera  Buena para las dos dosis utilizadas; respecto de la vacuna B la protección es Suficiente con la dosis de 0.50 ml y Buena con la dosis de 0.25 ml; la vacuna C protege en forma Suficiente con la dosis de 0.50 ml y es considerada Mala con la dosis de 0.25 ml.

Discusión

Los resultados indican que las tres vacunas probadas ofrecen una protección adecuada frente al serotipo 2. Esto era de esperar si consideramos que las vacunas son elaboradas a partir de cepas de este serotipo y que su control, mediante pruebas de potencia se efectúa también con cepas del serotipo 2.

Cuando el desafío se efectuó con el serotipo 19, las tres vacunas protegieron, aunque en menor intensidad que frente al serotipo 2. La vacuna A demostró proteger a la totalidad de los ratones a diferencia de las otras dos. Las cepas de desafío de los serotipos 2 y 19 contra los que hubo protección adecuada, fueron aisladas desde tonsilas de cerdos aparentemente sanos, considerados portadores (Díaz y col., 1980).

La cepa de serotipo 10 demostró, desde un inicio, una menor capacidad patogénica tanto por ser necesario un mayor período para su animalización como por necesitar una DML más elevada. La protección frente a este serotipo no pudo ser evaluada adecuadamente, en especial con la vacuna A, donde no se apreciaron diferencias significativas entre las proporciones de muertes del grupo testigo y los grupos vacunados; sin embargo a pesar de que el desafío se considera débil, pudo apreciarse cierto grado de protección en los dos grupos vacunados con la vacuna A. Frente al mismo serotipo 10, la vacuna B mostró un grado de protección adecuado sólo en los ratones vacunados con la dosis menor (0.25 ml), existiendo un número apreciable de muertes al utilizar 0.50 ml como dosis. Este hecho, que puede parecer contradictorio, podría explicarse como el efecto de un problema de hipersensibilidad a componentes bacterianos generados por el tipo de vacuna a la que corresponde la vacuna B. La vacuna C, no fue protectiva frente al serotipo 10, incluso cuando se aplico en la dosis de 0.50 ml. Antecedentes entregados por otros autores indican que vacunas preparadas a partir del serotipo 10, inducen en cerdos una protección específica frente al desafío, sólo con cepas homólogas (Wood, 1979). También se ha demostrado que las cepas de este serotipo tienen una marcada resistencia a la inmunidad generada por bacterinas estándares y se recomienda la introducción de este serotipo en la elaboración de productos vacunales contra erisipela porcina (Wood y col., 1981 a). Por lo observado en este estudio, en nuestro país ocurriría algo similar.

El desafío con el serotipo 14, demostró una protección total de la vacuna A, una protección adecuada con la vacuna B y para la vacuna C, una protección menos aceptable.

En general y con excepción de la vacuna A, las pruebas con los serotipos 10 y 14 presentaron un mayor número de ratones vacunados que mueren post–desafío, lo que implicaría que las vacunas utilizadas no protegieron adecuadamente frente a estos serotipos.

El hecho que las cepas utilizadas en este estudio fueran escogidas dentro de cada serotipo sin un esquema especial de selección, deja la incógnita sobre la existencia de diferencias de comportamiento entre cepas de un mismo serotipo.

Las vacunas utilizadas en esta experiencia fueron controladas en forma regular por organismos oficiales que utilizan una prueba de desafío con cepas provenientes exclusivamente de cuadros agudos (serotipo 2), pero no de cuadros crónicos artríticos, ni de portadores aparentemente sanos. Estas últimas han demostrado experimentalmente patogenicidad para cerdos y ratones y potencialmente podrían, dándose las condiciones apropiadas de manejo y factores de estres, representar un problema para la producción porcina (Wood y Harrington, 1978; Wood y col., 1981 b: Takahashi y col., 1987).

Se considera que los procesos artríticos de cerdos, donde está involucrada E. rhusiopathiae, tienen una frecuencia de 15% a 75% en países extranjeros (Grey y col., 1941: Tittiger y Alexander, 1971) y de 69% en Chile (Alegría y col., 1984); por esto las vacunas deberían cubrir no sólo la presentación aguda de la enfermedad sino también los problemas crónicos de erisipela, como la artritis.

Respecto a la utilización del ratón como modelo biológico para este ensayo, este es aceptado por la mayoría de los países donde se realiza control de vacunas contra erisipela. El British Veterinary Codex (1965) y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA/APHIS,1982) establecen a esta especie como patrón para la realización de los estudios de protección. El ideal de utilizar cerdos está limitado por aspectos económicos y prácticos.

Entre las cepas de desafío utilizadas, existió una manifiesta diferencia de patogenicidad demostrada por los diferentes períodos que demoró el proceso de animalización y la concentración de la DML que se determinó para cada una de ellas.

Se apreciaron reacciones inflamatorias y edematizantes en las extremidades de algunos ratones, durante el cálculo de la DML y también en el desafío post–vacunación. Esto fue más evidente en ratones inoculados con la vacuna B y desafiados con el serotipo 14. Se observó además que otros ratones, de las mismas condiciones, presentaron necrosis de la porción distal de la cola.

Las vacunas mismas no fueron totalmente inocuas para el ratón, pues los productos A y C desarrollaron abscesos estériles en el punto de inoculación, lesiones de aparición variable y cuya intensidad estuvo directamente relacionada con la mayor dosis utilizada en especial con la vacuna C. La vacuna B nunca produjo este tipo de lesión. Este efecto se debería a la composición de los productos, en especial de adyuvantes. También, las vacunas por sí solas fueron capaces de producir mortalidad, puesto que 8 días post–inoculación murieron 4 ratones de los inoculados con vacunas A y C, y 2 a 3 días de aplicada la vacuna B se verificaron 17 muertes de un total de 96 ratones en que se utilizó este producto. Esto último se apreció principalmente al utilizar la dosis de 0.50 ml. Se estima que estos efectos se deberían a componentes tóxicos propios de E. rhusiopathiae que contendrían las vacunas. La vacuna B, que produjo una mayor mortalidad, es un preparado que comprende un proceso de sonicación y ruptura del cuerpo bacteriano que libera mayor cantidad de elementos tóxicos y podría ser esta la razón de la mortalidad superior que generó.

La vacunación de un número mayor de ratones de los que finalmente se utilizaron fue una medida acertada pues se pudieron conformar grupos de entre 11 a 12 animales al momento del desafío.

En este estudio, se pudo comprobar que las vacunas utilizadas, que corresponden a las habitualmente comercializadas en el país, no protegen en igual forma a los ratones desafiados con cepas de los serotipos que presentan mayor frecuencia en cerdos portadores aparentemente sanos y en casos de artritis de esta especie. La deficiente protección conferida frente a algunos serotipos, hace pensar que no es igual usar cualquier vacuna si se quiere proteger más allá del cuadro agudo.

Bibliografía

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